摘要：

       尋找超聲破碎后高效率提取致齲菌變異鏈球菌蛋白質(zhì)的*佳放置時(shí)間。方法　以裂解液為提取介質(zhì)，采用超聲法破碎**。對(duì)比破碎前、后菌形態(tài)并將菌提取液分別放置０ 、１０ 、３０ 、５０ 、７０ min 收集蛋白上清液，通過(guò)RC DC 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度及蛋白質(zhì)SDS‐PAGE 電泳，比較放置不同時(shí)間后的蛋白質(zhì)提取效果。結(jié)果　超聲破碎后，少部分**破碎不完全。RC DC法測(cè)定結(jié)果顯示，超聲破碎后放置３０ min 時(shí)提取的蛋白質(zhì)濃度高于其他各組（P ＜ ０ ．０５） ，但SDS‐PAGE 電泳顯示蛋白質(zhì)的條帶分布和豐度無(wú)明顯差別，推測(cè)蛋白質(zhì)的釋放和溶解需要一定時(shí)間完成。結(jié)論　超聲法提取變異鏈球菌蛋白質(zhì)后放置３０ min 可顯著提高蛋白質(zhì)提取效率。變異鏈球菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁厚且堅(jiān)韌難以破碎，一般采用的破碎方法有反復(fù)凍融結(jié)合超聲法、氧化鋁粉末混合研磨法、玻璃珠勻漿法以及高壓法等［６‐８］ 。超聲波破碎法是目前提取**蛋白時(shí)常用的技術(shù)手段［９‐１０］ 。Thongboonkerd等［１１］研究認(rèn)為僅通過(guò)超聲即可使化膿性鏈球菌達(dá)到８０％ 的破碎，但無(wú)明確評(píng)價(jià)**破碎程度的指標(biāo)。超聲破碎法在大大提高蛋白質(zhì)提取效果的同時(shí)，還能增加蛋白質(zhì)的溶解性［１２］ ，且可避免外源性蛋白質(zhì)對(duì)樣本的污染［１３］ 。已有實(shí)驗(yàn)表明超聲破碎變鏈菌效果明顯［９ ，１４］ ，而在變鏈菌蛋白質(zhì)組研究中，如何提取樣本的*大量對(duì)結(jié)果至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)將超聲破碎結(jié)束的變鏈菌菌懸液分別放置不同時(shí)間，在菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)充分溢出并溶解后，對(duì)其中的蛋白進(jìn)行構(gòu)成及量的測(cè)定，探索放置時(shí)間對(duì)菌懸液中蛋白質(zhì)提取效率的影響。SDS‐PAGE 電泳可根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同分離混合蛋白質(zhì)，是分析各蛋白質(zhì)構(gòu)成變化的有效手段［１４］ 。本實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果顯示，超聲后放置不同時(shí)間的菌懸液中蛋白質(zhì)的條帶分布及豐度基本相同，提示放置時(shí)間對(duì)菌懸液中蛋白質(zhì)的構(gòu)成無(wú)明顯影響，但對(duì)濃度的影響無(wú)法通過(guò)SDS‐PAEG 電泳**展示。本實(shí)驗(yàn)采用的RC DC 試劑盒法以Lowry 法為基礎(chǔ)，并能夠兼容裂解液中多種試劑成分，同其他蛋白質(zhì)定量測(cè)定方法相比，具有精密度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)［１５‐１６］ 。定量結(jié)果表明，超聲破碎后放置３０ min 的菌懸液中蛋白質(zhì)的濃度*高；放置時(shí)間少于３０ min 的菌懸液，隨時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，而超過(guò)３０ min 所提取的蛋白質(zhì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)濃度下降。經(jīng)掃描電鏡觀察，大部分**破裂后呈絮狀碎片，極小部分**呈現(xiàn)清晰的殘余菌體形態(tài)，個(gè)別變鏈菌菌體較為完整。提示胞壁破裂完全的**胞內(nèi)物質(zhì)已充分外流，蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的釋放較徹底。而形態(tài)完整的**胞壁上可能存在有較小的裂口，猜測(cè)它們和存在殘余菌體的變鏈菌胞內(nèi)物質(zhì)的釋放需要一定時(shí)間完成。在測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度時(shí)，需保證菌體內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)充分溶解于提取介質(zhì)中。而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的釋放量少，或出現(xiàn)蛋白降解、沉淀等情況時(shí)，即導(dǎo)致提取介質(zhì)中蛋白質(zhì)的溶解減少，使測(cè)量濃度偏低。本實(shí)驗(yàn)采用的提取液中含有的脲和硫脲等可以充分破壞蛋白質(zhì)之間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集。還原劑DTT 能夠幫助打開(kāi)蛋白質(zhì)的二硫鍵，促進(jìn)半胱氨酸殘基被還原，使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。而蛋白酶抑制劑PMSF 可有效抑制**自身所釋放的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解。由數(shù)據(jù)可看出，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與裂解后放置時(shí)間在０ ～ ３０ min 范圍內(nèi)成正相關(guān)。由此提示，一方面，蛋白質(zhì)的釋放可能隨時(shí)間的延長(zhǎng)增加；另一方面，提取介質(zhì)中復(fù)雜的試劑成分與蛋白質(zhì)、水解酶的相互作用可能并沒(méi)有伴隨裂解過(guò)程的結(jié)束而終止，而在裂解后的一段時(shí)間內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行。同時(shí)，蛋白酶抑制劑PMSF 主要抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，而菌體內(nèi)釋放的其他蛋白酶可能仍存在活性，它們?cè)谌芙夂笈c蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度的降低。但放置３０ ～ ７０ min 與蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性無(wú)明顯規(guī)律，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。